生物成像能够高度清晰的对各种生理和病理过程进行实时监测并使各种生物实体可视化，因此对于生命科学和医学领域的发展是至关重要的。多年以来，生物成像在成像性能和不同功能的成像技术上都取得很大进展，利用某些生物分子和分子标志物来阐明各种疾病背后的各种复杂的分子和入胞机制，使得研究人员和临床医生能够更深入地了解生命系统。同时，因为它可以进行更精确和有效的疾病诊断，从而改善患者的治疗效果，所以生物成像对于临床前研究和临床应用也很重要。而近红外就是目前最实用的一种。其中，“近红外-II”波长在1000~1700 nm比可见光区（400~700 nm）以及“近红外-I”（700~900 nm）存在着更高的空间分辨率、更深的穿透生物基质的深度、较低的光学吸收和散射和具有最小的组织自发荧光现象。目前，利用NIR-II荧光和光声（PA）成像的无创成像技术，就体现了NIR-II光学成像的巨大吸引力。因此，NIR-II生物成像由于其在临床前研究和临床实用方面的巨大潜力而得到越来越多的探索。
近日，Adv. Mater.在线刊登了新加坡国立大学的刘斌教授（通讯作者）等人总结的题为“Recent Advances of Optical Imaging in the Second Near-Infrared Window”综述，报道了NIR-II光学成像的进展。文中从三个方面讲述了NIR-II：首先强调NIR-II光谱区在生物成像中的重要性，然后讨论各种NIR-II光谱区荧光成像和PA成像探针及其应用的出现和最新发展，最后给出了NIR-II光谱区生物成像的前景和所面临的挑战。
1、近红外-II (NIR-II)
生物化合物和组织（如血液、脂肪和皮肤）都能特定地吸收和散射不同程度的任何入射光。因此，光学成像必须在特定的电磁光谱区域中工作且需要光衰减最小，以改善成像对比度和灵敏度以及减少背景噪声。由于NIR-I光谱区存在有限的组织穿透深度、大量的组织自发荧光和明显的背景噪声缺点，所以NIR-I仍然不是最佳选择。通过第一次使用生物相容性的单壁碳纳米管(SWCNTs)在950~1400 nm之间发射的高灵敏度体内血管的NIR-II生物成像后，引发了其他领域的NIR-II荧光探针的发展，如半导体量子点、等离子体纳米粒子、有机半导体聚合物和小分子，用于各种生物成像（体外活细胞成像、体内血液循环跟踪、脉管系统成像、脑损伤检测和肿瘤检测）。总之，虽然NIR-II生物成像对于临床前应用非常有前景，但是其全部潜力只能在高效NIR-II造影剂和高灵敏度、快速光电探测器的同时存在下实现。
Figure 1. 生物组织和光电探测器在200~1800 nm范围内的光学特性。 a)光学波长在各种生物实体的衰减，例如含氧和脱氧的全血、皮肤和脂肪（NIR-I，700~900 nm，粉红色阴影；NIR-II，1000~1700 nm，灰色阴影）；b)不同类型的光电探测器的量子效率。基于硅（Si），铟镓砷（InGaAs）和碲化汞镉（HgCdTe）的光电探测器作为波长的函数。
2、NIR-II荧光成像
荧光成像能够提供出色的空间和时间分辨率，还具有快速的采集时间、需要较少的复杂仪器的操作和无创无害的优点。因此，传统的NIR-I荧光成像已广泛于各种临床应用，例如荧光素血管造影、脉管系统成像和癌症监测。然而，NIR-II展示其在生物成像上的独特优势，例如高选择性活细胞成像、脑血管系统和深部脑肿瘤的高分辨率穿头颅成像以及对血流的实时超快速监测。研究人员致力于开发高发射性和生物相容性的无机和有机NIR-II荧光材料，其具有明亮的荧光和超过1000 nm的发射最大值。
2.1、无机纳米材料的NIR-II荧光成像
2.1.1、单壁碳纳米管（SWCNTs）的NIR-II成像
Figure 2.单壁碳纳米管(SWCNTs)的NIR-II荧光成像。
a）具有水溶性接有PEG的SWCNT复合物的示意图；b）在808nm激光激发下SWNT-IRDye800复合物的发射光谱；c）由高放大物镜拍摄的子区域的放大的脑血管图像，具有0.80 mm×0.64 mm的视野。插图：沿着虚线黄色条的横截面强度曲线（黑色）和高斯拟合曲线（红色）； d）在NIR-1、NIR-II和NIR-II b区域中没有开颅的荧光小鼠脑血管图像。
2.1.2、金属硫化物、宽带隙半导体和稀土纳米粒子的NIR-II荧光成像
Figure 3.无机纳米材料的NIR-II荧光成像。
a）小鼠模型中肿瘤诱导的血管生成的实时图像。在4T1肿瘤移植后不同天数尾静脉注射PEG化Ag2S 量子点后30分钟后荧光图像。红色箭头指向肿瘤诱导的血管生成，如NIR-II PEG化Ag2S 量子点所示，而白色箭头指向4T1肿瘤； b）白蛋白纳米笼中应用Ag2S量子点用于多峰NIR-II荧光/ PA成像和光热疗法的示意图； c）Ald / DOX @ Ag2S纳米颗粒的结构和组成的示意图； d）Ald / DOX @ Ag2S纳米颗粒在各种骨组织（包括脊柱、腿骨和尾巴）中的NIR-II荧光图像；e）NIR-II荧光下转换纳米颗粒（DCNP）负载的中孔微载体，即SiO2 -Nd2SiO2 @ mSiO2-NH2 @ SSPI的示意图；f）载有蛋白质-NPTAT复合物的微载体在730 nm或808 nm激发下在不同时间对小鼠进行NIR-II荧光成像。
2.2、有机纳米材料的NIR-II荧光成像
2.2.1、共轭聚合物的NIR-II荧光成像
Figure 4.共轭聚合物的NIR-II荧光成像。
a）pDA聚合物的合成路线；b）pDA-PEG纳米颗粒的吸光度、荧光吸收和发射最大值分别为654和1047nm；c）各种pDA聚合物的化学结构；d、e）不同pDA聚合物的吸光度和荧光，表明pDA聚合物通过其化学结构的改性的光学性质的可调性；f）静脉内注射的pDA-PEG纳米颗粒随时间推移小鼠后肢股动脉血流的NIR-II荧光成像。 血流前方用红色箭头表示。
2.2.2、有机小分子的NIR-II荧光成像
Figure 5.有机小分子的NIR-II荧光成像。
a）CH1055及其衍生物（即CH1055-PEG和CH-4T）的化学结构，以及基于DMSO中的EDC/NHS偶联和DMSO中HBTU/DIPEA偶联产生CH1055-PEG和CH-4T的合成途径；b）CH1055-PEG的吸收和发射光谱；c）CH1055-PEG随时间的体内血液循环和尿液排泄的特征，表明其快速从体内清除；d）各种NIR-II造影剂的光学照片，即单壁碳纳米管（SWCNT）、CH-PEG和不同处理的CH-4T以及它们各自的NIR-II荧光图像；e）在将ICG和CH-4T/HSA-HT顺序注射到其足垫中之后，小鼠的深淋巴结的NIR-1和NIR-II荧光图像（如白色箭头所示）。
2.2.3、聚集诱导发光（AIEgens）的NIR-II荧光成像
Figure 6.具有选择性靶向有机小分子和超亮的NIR-II荧光成像。
a）小分子NIR-II染料CH1000的化学结构；b）EGFR affibody固定的CH1000纳米颗粒即Affibody-DAP的示意图；c）使用affibody-DAP和随时间阻断的甲状腺肿瘤的靶向体内NIR-II荧光成像的信号强度的变化； d）具有聚集诱导发射（AIE）特征的TB1的化学结构； e）TB1点的UV-vis吸光度和荧光光谱； 插图显示在溶液（左）和粉末（右）形成的TB1的荧光图像； f）在不同时间点使用TB1-RGD点（顶部）和TB1点（底部）对原位脑肿瘤进行靶向NIR-II荧光成像。
3、NIR-II光声成像
PA成像（光声成像）是一种将光激发与超声波检测相结合的混合生物成像模式。因为它能够克服光学漫射阈值以及传统光学成像有限的成像和穿透深度，所以是一种最有前景的替代传统光学成像的方案。PA成像是依赖于在吸收激发光之后检测由成像的生物目标产生的声波，具有很强的光学吸收灵敏度（比光学相干断层扫描和共聚焦显微镜高约100倍），因此与光信号相比，在生物组织内超声波的散射大大减少（≈1000倍以下）。由于PA成像可以实现深达几厘米的穿透深度，并产生具有显着增强的空间分辨率和丰富对比度的图像，故而无创PA成像具有巨大的临床前研究和临床应用潜力。
Figure 7.半导体聚合物的NIR-II PA(光声)成像。
a）SP2的化学结构； b）通过纳米沉淀技术制备的具有NIR-1和NIR-II PA成像能力的SP2纳米颗粒（SPN-II）；c）静脉内注射SPN-II后70分钟，在750 nm（左）和1064 nm（右）进行大鼠皮质的体内PA成像；d）P1的化学结构；e）制备的P1纳米颗粒在不同波长下的PA强度；f）在施用P1纳米颗粒后的不同时间点的原位脑肿瘤的体内NIR-II PA成像。通过灰色超声图像指示颅骨边缘，而PA图像中的绿色信号显示纳米颗粒分布，表明距离颅骨3.4 mm处存在脑肿瘤。
Figure 8.半导体聚合物用于厘米深度NIR-II PA(光声)成像。
a）噻吩并靛蓝-三甘醇（TII-TEG）的化学结构；b）跨越不同波长的基于TII的半导体聚合物纳米颗粒（TSPN）、血红蛋白（Hb）、水（H2O）和脂质（由橄榄油表示）的PA强度；c）TSPN的信噪比（SNR）与从1064 nm处的激光激发照射的组织表面的深度的函数关系；d）在不存在（顶部）和存在（底部）不同波长的TSPN的情况下，小鼠肿瘤（点状白色圆圈）的体内PA成像。
4、总结与展望
通过对生物成像的最新进展的调研，已经证明NIR-II光谱区域已经是最有希望替代可见光和NIR-I光谱区域。NIR-II在生物组织中具有较低的消光系数，导致生物实体与较长波长光子之间的相互作用大大减少，减小了光学吸收、散射和组织自发荧光。这极大地推动了各种具有NIR-II吸收和发射能够在超过1000 nm的较长波长发射PA或荧光信号外源造影剂的设计和开发用于NIR-II生物成像。越来越多的概念验证研究已经探索了它们的生物成像应用，并获得了比目前成熟使用的NIR-I更深的渗透深度，更好的对比度和分辨率，这使得NIR-II生物成像在临床前成像研究和临床应用方面具有巨大的潜力。但是NIR-II生物成像技术目前仍处于起步阶段，与大多数新发现或开发的成像技术类似，NIR-II生物成像存在许多挑战。主要涉及如下：（1）设计和/或选择核心材料和功能组/识别元素以形成外源NIR-II探针；（2）优化其光物理特性以匹配可用的成像系统；（3）评估其生物相容性，药代动力学和毒性；（4）NIR II光学光电探测器和成像系统的开发和优化。总之， NIR-II生物成像将如何广泛用于补充甚至替代当前的生物成像技术，以满足当前生命科学和医学研究的要求是还有待观察。 但是，相信随着NIR-II生物成像技术的不断进步以及NIR-II成像系统的成本逐步降低，这种成像技术将被广泛采用。
文献链接：Recent Advances of Optical Imaging in the Second Near-Infrared Window（Adv. Mater., 2018, DOI: 10.1002/adma.201802394）
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目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。
传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。
近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780?1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。
近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。
相机部分：
1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；
近红外小动物活体成像
2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；
3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；
4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；
激光部分：
1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；
2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；
3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；
暗室及控制系统：
1、去除背景，实现成像的平场校正功能；
2、调节红外成像窗宽、窗位功能；
3、荧光寿命成像专用软件模块‘；
4、实现材料长时间的荧光寿命成像；
5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；
6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；
应用：
适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。
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【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：
【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较
通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm?2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。
【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试
特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。
【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测
临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。
【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用
稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。
缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。
【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测
利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。
【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测
准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。
【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测
近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。
【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测
细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。
【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析
准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。
（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。
（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。
【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术
NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。
【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗
纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。
【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命
