动物细胞及组织基本培养技术

将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程，称为细胞培养。体外培养可分为原代培养（亦称初代培养）和传代培养（亦称继代培养）。原代培养是指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。初次培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。在体外环境条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。

（一）体外培养的细胞根据其生长方式

1．贴壁型依赖性细胞

生长时需要附着于某些带适量正电荷的固体或半固体表面，大多数动物细胞体外培养时，均以此种方式生长。非淋巴组织的细胞、多种异倍体细胞也属此种类型。

2．非贴壁依赖性细贴胞

此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养基中悬浮生长，血液、淋巴组织细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。原则上各种动物组织都可以进行体外培养。而实际上幼体组织比老龄组织更容易培养，尤其是胚胎组织。分化程度低的比分化程度高的容易培养；肿瘤组织比正常组织容易培养。任何动物细胞培养均须从从原代培养开始。

2.培养方法

（1）取材

首先要对所取动物组织的各种情况做详细记录。从动物体内取材必须严格遵守无菌操作。所用器皿事前经严格的消毒灭菌。采用各种适宜的方法处死动物，取出组织放入小烧杯中，用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎成1mm³大小，用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎块，补加3～5mL Hanks液，用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。也可用两手术刀片将组织块切碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间长，容易污染。对某些软组织如肿瘤、胚胎、脑等可将碎组织块放入注射器玻璃管中挤压分离。也可用1mm、10?m、20?m三种规格的不锈钢或尼龙网筛挤压分离，但对较硬的组织和纤维组织效果不好。

（2）分离

组织消化法是用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。常用的消化液有：胰蛋白酶适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代细胞等。

操作方法：

1）将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶种，加入30～50倍体积的0.25％胰蛋白酶；

2）37℃水浴内消化30～60 min，每5～10 min摇动一次，根据效果可中间更换消化液，静止10 min，吸去2/3清液。补加新鲜胰蛋白酶；

3）Hanks液漂洗两次，每次2～3 min；

4）800r/min离心5 min，弃上清液，加入营养液，如有大块，可用纱网过滤。如消化传代细胞，可与EDTA混用。

胶原酶——这种用细菌提取的酶对胶原和细胞间质有较强的消化作用。使用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。此酶步受Ca²⁺、Mg²⁺的螯和作用，可用BBS和含血清培养基配制成浓度为200u/ml或0.1～0.3 mg/ml的溶液。其作用温和，无须机械震荡。

5）培养瓶中放入1～5 mm³大小的碎组织块，加5 ml 2000u/mL的胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5；

6）36℃水浴24～48 h，视情况可适当延长，无需震荡，期间可更换酶液一次；

7）见组织块已变软，分散于瓶低，轻微震荡即散成细胞团或单细胞，小心倒出培养液，瓶低可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开，单独培养或弃之不用；

8）800r/min离心5 min，弃上清液，重悬于BBS液中，在重复离心一次；

9）加入培养液制成细胞悬液用于接种。

其他的酶如链酶蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于培养细胞的消化。需根据酶的作用特点及组织成分的不同适当选用。EDTA最适用于消化传代细胞，常与胰蛋白酶配合用，方法如前所述。

10）细胞计数

细胞悬液制成后，需要计数悬浮液中细胞的浓度，通常以“细胞个数/ml”表示。在培养贴壁细胞或悬浮细胞时也需要检查培养液中的细胞浓度，检查方法如下：

在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，在加入0.4%台盼蓝（锥虫蓝）1滴，混匀后静置2～3 min；将计数板平放在显微镜台上，在盖片边缘加入1～2滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间的空间，勿留气泡，勿使盖片漂浮。

A. 在显微镜下记录计数板四角四个大格中的细胞总数，原则是染蓝的细胞不数（死细胞），无色的细胞计数（活细胞，压线的细胞，数上不数下，数左不数右，一团细胞按一个细胞计数；

B. 按下列公式计算细胞悬浮浓度：

细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）×10⁴×稀释倍数计数时要注意：如果细胞团数超过10%，说明消化过程进行得不充分；如果细胞数少于20个/mm³或多于50个/mm³说明稀释不当，需重新操作。

（3）常用培养法

1）组织块培养法

将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶（皿）中，贴附一段时间后，细胞从组织块长出，最终形成单层细胞。该法简便，适合上皮细胞、骨骼肌细胞的原代培养，更适合组织量少的牙髓细胞原代培养（用盖玻片条培养法）。

2）悬滴培养法

组织培养是Harrison（1907年）和Carrel（1912年）等首先发展建立的体外组织培养方法。他们在载玻片或盖玻片上滴上血浆或淋巴液，将一小片组织埋于血浆或淋巴液中，加胚胎浸出液和血清，混合，血浆凝固固定组织块，胚胎浸出液和血清提供营养，细胞从外植块向四周迁移生长。悬滴培养法是最简单和最原始的培养法。

将培养的组织剪成1 mm³的小块为宜。图中使用一片较大的方盖片和一片小盖片粘附在一起，是为了换液和传代方便。加血浆，接种组织，再加胎汁使之与血浆充分混合。稍置片刻待血浆凝固，则组织小块被凝固于血浆胎汁混合物中。然后取一凹玻片，四角涂凡士林少许，把盖片反转粘附在凹玻片上。随后沿方盖片四周涂融蜡封闭，勿使其漏气，置于37℃温箱培养。

此法细胞生长空间狭小、气体不足，细胞不能持续长时间生长，培养基易液化，需要常更新培养基。其次是凹玻片折光，不便于直接观察活细胞和摄影。

3）卡氏瓶培养法

为了扩大细胞生长面积和空间，Carrel设计了卡氏瓶培养，此法与双盖玻片法原理相似，不同的是组织块被植入到特别的卡氏瓶中培养。细胞在卡氏瓶中，气体充足，附着面宽阔，营养丰富，细胞能较好地生长，而且卡氏瓶适合观察。操作方法是：

A．将组织剪切成细小碎块后，用平衡盐溶液漂洗。

B．组织碎块转移到第二只培养皿中，在解剖显微镜下，将不需要的组织诸如脂肪或坏死的材料，用外科手术刀交叉解剖掉，将组织块切成约1mm³小块。

C．用滴管将组织小块移到消毒离心管或普通容器内（注意吸管在吸组织小块前，先用平衡盐溶液弄湿内表面，否则易粘着组织小块）。静置使组织小块下沉。吸去上清液，换入新鲜平衡盐溶液漂洗组织小块，如此重复两到三次。

D．将组织小块转移到培养瓶内，每只体积为25 ml的培养瓶内可放置20～30块组织小块，吸去液体。在每只25 ml培养瓶内加入1ml生长培养液，轻轻地倾斜摆动培养瓶。使组织小块均匀地分布于生长瓶内壁表面上。把瓶盖盖上，放入恒温培养箱内或放入36.5℃暖房内，静置18～24 h。

E．待组织块均已沾附玻壁上后，经过3 ~5 d，在每只25 ml的培养瓶内加5 ml培养液，然后每周更新培养液一次。培养3～5周，组织块周围的生长晕不断地增长，当细胞从组织向四周伸展，细胞生长较多时用肉眼或低倍镜下观察犹如日晕，称“生长晕”。

F．将生长晕中央的组织块用外科小刀取出，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶中，从步骤④起重复操作。

G．在吸去组织块的生长晕培养瓶内，换入新鲜培养液继续培养。待生长晕细胞扩展到盖住培养瓶底约50%表面时，用来进行细胞培养。

4）单层细胞培养法

自20世纪50年代，细胞培养技术有两个大的改进：一是在研究细胞代谢的基础上开始应用合成培养基，二是采用了胰酶消化分散细胞的技术，把组织团块分散成较小的细胞团或单个细胞。采用这些措施的结果，细胞不仅在培养环境中长得更好，而且由于细胞生存在液体培养基中，无血浆支架，只能附在瓶壁上长成单层，形成所谓单层细胞培养。

单层细胞培养更进一步促进了组织培养法的发展。由于单层细胞便于传代和观察，从而演变出了建立长期传代的细胞系和单细胞分离培养纯细胞株的技术，使组织培养技术更趋完善。

单层细胞培养有下列几点好处：①更换新鲜培养液比较容易，可先用血清培养液培养，然后可方便地换为无血清培养液培养，用于观察某些因子加到培养液后的作用，以及从培养液中减去某些因子后对细胞生长的影响；②如实验要求细胞密度较高时，较容易采用灌注技术提供高密度细胞所需要的营养成分；③当细胞粘附在基底质上后，更容易表达某些产物；④单层细胞培养更适用许多细胞系。

单层细胞培养法：取材后剪成1～3 mm³的小块，经过消化分离，细胞计数，分装入培养瓶中保温培养，如图3-6（消化法初代培养基本步骤）所示。

培养过程中随着细胞的增长，尤其在细胞生长十分旺盛时，代谢产物堆积，CO₂增多，营养液氢离子浓度升高，酚红指示剂颜色变黄。如估计营养成分未耗尽，此时只需加入少许NaHCO₃调节即可；如营养成分已枯竭，则需重新更换营养液。在使用自控CO₂温箱时培养瓶塞用无菌纱布棉塞，箱内稳定提供5% CO₂，能保持培养液恒定pH值。

传代培养：当细胞生长铺满瓶底，需进行传代培养。细胞分裂增殖扩展连片，占满器皿表面，这时需要对其分离，并重新培养，这一操作过程称之为传代。有80%～90%或刚刚全部汇合的细胞，是传代的理想时期。过早，细胞产量不足；过晚，致使细胞健康状态不佳。因此，把握好时机很重要。另外，细胞对酶的消化作用反应不一，有的敏感，有的迟钝。根据细胞特点，适度掌握细胞消化时间和选择适宜的方法很关键。处理得好，细胞损失少，细胞浓度均匀，细胞生长速度一致。具体方法如下：参见图3-7（消化传代培养法）。

① 吸出培养瓶内旧培养液；

② 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底；

③ 作用2～5 min，检查，如有细胞间隙变大，细胞质回缩现象，终止消化；

④ 吸出消化液，加入Hanks液，轻轻转动以免细胞流失，洗去残留的消化液，如果单用胰蛋白酶，可直接加入培养液，免洗；

⑤ 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，记数后记录其浓度；

⑥ 重新接种培养。

此法可大量培养细胞组织，特别适用于生物制品生产，但用于经常性细胞培养研究则太繁琐，易染菌。

5）组织块单层细胞培养法

此法的特点在于把组织剪成更小的小块（0.5～1 mm³大小），在不加任何粘着剂的情况下，由于组织体积很小，能直接附于瓶壁上，细胞自组织块边缘向外长出，最后连接成片形成单层细胞，从而简化了原代单层细胞的培养过程。组织块单层细胞培养法，是当前各培养室常用的初代培养法，如图3-8（组织块单层细胞培养法）所示，操作过程如下：①取一定量组织置于青霉素瓶中，先用BSS漂洗2～3次去掉血污，然后用眼科钳反复剪成0.5～1 mm³的组织块。②加入1～2 ml培养液，用吸管轻轻吹打，使细小组织块悬浮。③用吸管吸一些组织块加入培养瓶中，用弯头吸管把组织小块在瓶壁上吹匀，翻转培养瓶混合，再补加充足营养液，塞紧瓶口，置于37℃温箱1～2 h，待组织块牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转培养瓶，令培养液浸泡组织小块，静止培养，亦可接入卡氏瓶中培养。

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